W roku 1501 Francuzi po raz drugi (po inwazji króla Karola VIII z 1495 r.) wtargnęli do Królestwa Neapolu, zajmując jego północną część (z miastem Neapol). Jednocześnie w Kalabrii pojawili się Hiszpanie, którzy zawarli potajemny sojusz z królem Francji Ludwikiem XII i opanowali południową część królestwa. Wkrótce jednak spory dotyczące interpretacji traktatu sojuszniczego doprowadziły do wojny między Francją a Hiszpanią. Początkowo, w lecie 1502, przewagę uzyskali Francuzi, gdy jednak Hiszpanie uzyskali posiłki, szala wojny przechyliła się na ich stronę. W bitwie pod Cerignolą w roku 1503 Hiszpanie pokonali armię francuską; po tym zwycięstwie wkroczyli do Neapolu. Kolejne porażki Francuzów pod Garigliano i Barlettą przyczyniły się do zawarcia w roku 1504 rozejmu w Lyonie między Hiszpanią a Francją, na mocy którego Ludwik XII otrzymał Mediolan, Neapol zaś dostał się pod władanie Ferdynanda II Aragońskiego.